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陈珏组展示了Ivacaftor在CFTR蛋白上的新靶点,助力治疗囊性纤维化疾病

2019-11-18 19:33:54
陈珏组展示了Ivacaftor在CFTR蛋白上的新靶点,助力治疗囊性纤维化疾病

2019年6月21日,陈珏教授课题组的博士研究生刘芳语和博士后张哲在Science杂志上发文,报道了Ivacaftor与CFTR蛋白复合物在离子通道预开放状态下的高分辨率冷冻电镜结构(3.3Å),清晰地展示了Ivacaftor在CFTR蛋白上的结合位点。这给治疗囊性纤维化疾病提供了新的方向。

美国洛克菲勒大学(Rockefeller University)陈珏教授研究组长期致力于对ABC转运蛋白家族重要成员的底物转运和功能机制研究,比如,与癌症抗药性相关的P-glycoprotein(Pgp)蛋白和multidrug resistanceprotein1(MRP1)蛋白,在抗原呈递中发挥重要作用的TAP蛋白,以及负责细菌中重要碳源麦芽糖转运的maltosetransporter蛋白。鉴于CFTR蛋白在ABC转运蛋白家族中功能的特殊性及其与囊性纤维化疾病的高度关联性,近年来,陈珏教授研究组对CFTR蛋白的结构和功能机制展开了深入的研究。2016年底至2018年底两年期间,陈珏教授课题组利用冷冻电镜(cryo-electronmicroscopy)技术成功解析了斑马鱼和人源CFTR蛋白在关闭和预开放两种功能状态下的高分辨率三维结构。通过结构分析并结合以往报道的大量生物物理和生物化学数据,陈珏教授课题组发现了CFTR蛋白区别于ABC转运蛋白家族其它成员转运蛋白功能从而具备离子通道活性的结构基础,其中包括细胞内侧离子通道出口的位置,以及一条特殊的不连续的跨膜α螺旋(Transmembranehelix, TM)8在不同功能状态下的显著构象变化。值得注意的是,为了适应细胞膜的疏水环境,大多数膜蛋白包括ABC转运蛋白往往利用连续的跨膜α螺旋实现跨膜定位。这是因为α螺旋可以将氨基酸残基疏水表面暴露出来的同时隐藏其具有亲水特性的区域,从而维持膜蛋白在磷脂双分子层疏水环境中的能量最低状态。陈珏教授课题组认为,TM8这种非连续的α螺旋结构虽然降低了其在细胞膜中的稳定性,但是随之产生的柔性和暴露的亲水基团,很可能是CFTR蛋白发挥离子通道功能所必需的,这也是它在不同功能状态下能够产生巨大的构象变化从而调控离子通道开关的结构基础。此外,通过与洛克菲勒大学David C. Gadsby教授和森梅威思大学La´szlóCsan a´dy教授的合作,陈珏教授课题组利用电生理实验进一步阐明了磷酸化修饰调控CFTR蛋白开关的分子机制,以及ATP的结合和水解与离子通道开关之间的动力学特征。

在完成了对CFTR蛋白功能机制的一系列研究之后,陈珏教授研究组迅速将精力投入到针对CFTR蛋白治疗囊性纤维化疾病的几种小分子药物作用机制的研究当中,希望揭示这些药物在CFTR蛋白上的精确靶点,进而指导下一代药物的研发。小分子增强剂Ivacaftor由Vertex制药公司研发生产,是第一个通过直接作用于CFTR蛋白治疗囊性纤维化疾病而被FDA批准上市的药物。它对30多个CFTR蛋白的致病突变皆有治疗效果。目前,人们只知道它能够增强这些CFTR蛋白致病突变的离子通道活性,但是却并不清楚该药物在CFTR蛋白上的结合位点和作用机制。

该结构显示,Ivacaftor结合在CFTR蛋白表面,恰巧处于TM8的非螺旋区域附近,这样即通过稳定TM8在离子通道开放状态下的构象从而起到延长CFTR蛋白开放时间的功能。为了验证该结合位点的保守性,作者进一步解析了CFTR蛋白与另外一种增强剂GLPG1837的复合物结构(3.2 Å),该分子由Galapagos公司研发并正处于二期临床实验阶段。该复合物结构显示,虽然GLPG1837的分子结构与Ivacaftor并不相似,但是其在CFTR蛋白上的结合位点却与Ivacaftor完全一致。由此表明,作者发现的这一结合位点很可能是一个针对CFTR蛋白药物的普遍靶点。接下来,作者将CFTR蛋白上参与增强剂结合的重要氨基酸残基都进行了定点突变,通过直接相互作用SPA(scintillation proximityassay)和电生理实验分析了这些氨基酸残基在两种小分子药物结合中的作用。至此,陈珏教授课题组鉴定出了CFTR蛋白上一个重要的药物作用靶点,这必将为随后的药物设计和研发提供重要的理论依据和指导。

图1. Ivacaftor结合在CFTR和细胞膜之间。A. CFTR结合Ivacaftor (品红)的总体结构。跨膜结构域(TMD) 1和核苷酸结合域 (NBD) 1用蓝色表示。TMD2和NBD2由绿色表示。调节结构域R domain)为红色。TM8被表示为圆柱形状。B. Ivacaftor的结合位点。Ivacaftor和TM4, 5, 8有相互作用。C.Ivacaftor和CFTR间的相互作用。黑虚线:氢键;竖线:芳香交互作用;放射形状:疏水的相互作用。D-F. CFTR结合位点的突变对Ivacaftor结合的影响。

文章的共同第一作者张哲博士即将于今年8月全职加入北京大学生命科学学院,建立自己的研究团队。接下来会依托北京大学顶尖的冷冻电镜平台,继续从事与重大疾病相关的膜蛋白的功能和结构研究。

关于囊性纤维化

囊性纤维化(Cystic Fibrosis)是一种由单基因突变引起的隐性遗传病,该基因编码了表皮细胞细胞膜上的阴离子通道CFTR(Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator)蛋白。CFTR蛋白属于ABC转运蛋白(ATP-binding cassette transporters)家族。该家族的绝大多数成员利用ATP结合及水解所释放的能量对不同的底物进行逆浓度梯度的主动跨膜运输,包括无机离子、营养物质以及药物等。但是,CFTR蛋白却是该家族中唯一一个发挥离子通道作用的成员,它通过控制Cl-和HCO3-等单价阴离子在细胞内外的流动来维持表皮细胞内外离子和水分的代谢平衡。囊性纤维化疾病广泛地影响多种器官和系统的功能,包括呼吸系统、消化系统以及男性生殖系统等。其最普遍的症状是由于水分和离子代谢失调所导致的各种管腔中的黏液积累,比如,肺部粘液积累会诱发细菌感染和呼吸衰竭,而胰腺中黏液积累则会引起消化液分泌障碍等。

囊性纤维化疾病主要影响北欧人群的后裔,每25人中即有1人为该病的携带者,平均每3000个新生儿中有1人患病。目前,全球的患者大约为8万人左右。自从1938年该病被发现以来,全球大量的研究者们试图通过多种方法对该病的致病机理和治疗方法进行研究。欧洲、美国和加拿大等多个地区和国家都有专门的基金会对相关的研究进行资金支持。经过几十年的努力,该疾病病人的平均寿命已经从婴幼儿期延长至47岁。但是,大部分针对该疾病的治疗手段均是间接的治疗方式,比如,利用清除黏液的药物对肺部的积液清理,以及使用抗生素对肺部细菌感染的抑制等。直到近些年来,人们才开始研发直接作用于CFTR蛋白的小分子药物,从而达到从根源上治疗该疾病的目的。2012年以来,有3种此类小分子药物先后被美国食品和药品管理局(FDA)批准上市。尽管这些药物为病人们带来了显著的疗效,但遗憾的是,这些药物价格昂贵,每个病人每年需要花费大约30万美金;同时,它们均来源于大规模的筛选,所以其作用靶点和机制并不清楚。

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